摘　要：从患病仔猪体内分离出病原菌，据其病原菌形态、培养特性和生化特性，鉴定为大肠埃希菌。药敏试验结果表明，该菌对丁胺卡那、头孢哌酮、头孢他定、头孢唑啉高度敏感，对呋喃妥因、阿莫西林中度敏感，对四环素、庆大霉素低度敏感，该菌致死小鼠。利用分离培养的细菌进行增殖培养，制备了生理盐水菌液和营养肉汤菌液两种灭活疫苗。结果表明菌种在普通琼脂斜面上生长旺盛，两种疫苗接种小鼠全部健活，生理盐水和营养肉汤菌液组免疫保护率分别达到75%和87.5%，说明疫苗安全有效。

关键词：仔猪水肿病；大肠埃希菌；分离鉴定；药敏试验；灭活苗 

仔猪水肿病是仔猪较为常见的一种急性、致死性疾病，俗称为“红眼病”和“小猪摇摆病”。该病主要发生于断奶仔猪，生长健壮的仔猪较常见，瘦小的仔猪较少发生。该病发病突然，病程短，死亡快，给养猪业带来了很大的经济损失，是当前发展养猪业的一大障碍。为了更准确的诊断和防治该病的流行，本试验在初诊为猪水肿病的基础上，进行了病原分离鉴定与灭活苗试制^[1]。

1　材料与方法

1.1　实验动物

患病猪由兰州榆中养猪场提供；健康小鼠购于兰州大学医学院试验动物养殖所。

1.2　培养基

普通营养琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、SS琼脂和三糖铁琼脂购自杭州天和微生物试剂有限公司；营养肉汤培养基、吲哚、甲基红和枸橼酸盐本实验自行配制。

1.3　生化试验管

葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、尿素、木糖、麦芽糖、卫矛醇、七叶苷购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.4　药敏纸片

红霉素(E)、四环素(TE)、庆大霉素(GM)、头孢唑啉(CZ)、头孢他定(CAZ)、万古霉素(VA)、青霉素(P)、丁胺卡那(AN)、苯唑西林(OX)、呋喃妥因(FM)、氨苄青霉素(AM)、头孢哌酮(CFP)、阿莫西林(AMC)和环丙沙星(CIP)药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.5　方法

1.5.1　病原的分离和鉴定　取病死仔猪肝脏和肠系膜淋巴结于普通营养琼脂、鲜血琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂和SS营养琼脂平板上划线，37 ℃培养24 h，选择麦康凯呈红色和典型溶血性菌落染色镜检，并接种斜面37 ℃培养24 h。

1.5.2　生化反应　将初选的可疑菌落纯化后分别接种于三糖铁琼脂和枸橼酸盐利用实验培养基、吲哚、甲基红、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、卫矛醇、尿素反应管内，37 ℃培养48 h～72 h。凡符合于大肠埃希菌属定义者留作抗原鉴定和致病性试验^[2]。

1.5.3　小鼠攻毒试验　取血琼脂上溶血菌落用生理盐水稀释，测得其浓度为1.6×10⁹/mL，再用生理盐水稀释为1.6×10⁸/mL用于攻毒试验。试验组小鼠3只，每只腹腔注射0.1 mL菌液，对照组3只，每只腹腔注射0.1 mL生理盐水，观察7 d，取死亡小鼠的肝脏和脾脏涂片染色镜检，并于普通营养琼脂、血琼脂和麦康凯琼脂平板上划线，37 ℃培养24 h^[3]。

1.5.4　分离菌的增殖　取麦康凯上呈红色和血琼脂平板上的溶血菌落，接种于普通琼脂斜面37 ℃培养18 h～24 h,4 ℃冰箱保存，作为一级种子备用。

1.5.5　药敏试验　用灭菌棉拭子沾取待检细菌37 ℃ 6 h的肉汤培养物，均匀地涂布在营养琼脂平板上，然后夹取各种药物纸片，均匀分布贴放到琼脂培养基的表面，置37 ℃温箱内培养18 h，测量抑菌圈直径大小^[5­6]。

1.5.6　灭活苗的制备

1.5.6.1　抗原液的制备　生理盐水菌液组：取一级种子接种于普通琼脂平板中，37 ℃培养18 h～24 h，用灭菌生理盐水洗下菌苔并混合均匀。

营养肉汤菌液组：取一级种子分别接种于营养肉汤中，37 ℃培养18 h～24 h。

1.5.6.2　纯度检验和活菌计数　抗原液制备完成后，取样用普通琼脂做纯度检验，同时进行活菌计数。

1.5.6.3　灭活　抗原液中缓慢加入甲醛溶液，使其终浓度为3 mL/L，于37 ℃振荡培养箱中培养48 h。

1.5.7　疫苗的检验

1.5.7.1　性状检查　生理盐水菌液组：疫苗静止后，下层有少许沉淀，上层为半透明液体，摇动后沉淀悬浮，呈均质白色混悬液。

营养肉汤菌液组：疫苗呈棕黄色半透明液体。

1.5.7.2　无菌检验　随机抽检样品，分别接种于普通营养琼脂斜面和鲜血琼脂板，37 ℃培养48 h，检查细菌生长状况^[4]。

1.5.7.3　安全检验　小鼠注射疫苗后，观察7 d，记录小鼠存活情况，试验分组设计见表1。 

表1　安全性试验设计

Table 1　The design of safety experiment

1.5.7.4　效力检验　30只小鼠随机平均分为2组，A组每只腹腔注射生理盐水菌液灭活苗0.2 mL，B组各腹腔注射营养肉汤菌液灭活苗0.2 mL，C组腹腔注射生理盐水0.2 mL作为空白对照。免疫14 d后，所有小鼠每只腹腔注射分离菌液0.1 mL(含1.6×10⁸/mL)，攻毒后观察10 d～14 d。

2　结果

2.1　病原菌的分离鉴定

经过5种培养基培养分离，病原在不同的培养基上生长状况有所不同，具体生长表现见表2。制片染色镜检为典型的革兰氏阴性球杆菌。

表2　病原菌分离结果

Table 2　The isolation of pathogeny

2.2　常规生化鉴定结果

可疑菌的生化反应特性均符合埃希菌属，属于溶血性大肠埃希菌(表3)。

表3　大肠埃希菌生化鉴别结果

Table 3　The Biochemical identification of E.coli

 注：“?”表示产酸产气；“－”表示阴性；“＋”表示阳性。

Note：“?”indicates that bacteria can produce gas and acid；“－” shows negative；“＋” shows positive.

2.3　小鼠攻毒试验结果

试验组小鼠第5天时全部死亡，对照组小鼠全部健康，无异常状况。

2.4　药敏试验结果

应用纸片法对致病性很强的分离菌进行了14种抗菌药物的敏感试验，该菌对丁胺卡那、头孢哌酮、头孢他定、头孢唑啉高度敏感，对呋喃妥因、阿莫西林中度敏感，对四环素、庆大霉素低度敏感，对红霉素、万古霉素、青霉素、苯唑西林、氨苄青霉素、环丙沙星不敏感(表4)。 

表4　药敏试验结果

Table 4　The result of drug sensitivity test

2.5　疫苗检验

2.5.1　无菌检验　随机抽检样品，用普通琼脂斜面，血琼脂板做无菌检验，结果无菌生长。

2.5.2　安全性检验　用12只小鼠将两种灭活疫苗分别肌肉和皮下注射免疫7 d后，均健康存活，无局部和全身反应。

2.5.3　效力检验　试验分3组进行，经过观察纪录，A和B两组小鼠发病率远远小雨对照组，呈显著性差异。死亡率也小于对照组，有一定的差异性。对于小鼠感染的保护率与对照组也有显著性差异。具体结果见表5。

表5　灭活苗效力检验结果

Table 5　The results of inactiated vaccine efficacy

注：免疫保护率＝(对照组死亡数－试验组死亡数)/对照组死亡数×100%。

Note：Immunoprotective rate＝(dead numbers in control group－dead numbers in experimental group)/dead numbers in control group×100%.

3　讨论

近年来随着养猪业的发展，仔猪水肿病的发生日趋严重。该病发病率虽不高，但病死率可达90%以上，给养猪业带来很大的危害，因此，早期预防是关键。但由于仔猪水肿病的病原血清型不同，且不同的血清型之间无交叉保护性，所以为了更好地预防本病，就必须制备仔猪水肿病自家灭活苗，进行仔猪水肿病的防治。一旦该病发生，要进行药敏试验，及时投喂最有效的抗生素，以尽快控制本病。试验通过观察临床症状、剖检变化，从病死猪肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结分离出病原，再通过一系列的试验，鉴定为溶血性大肠埃希菌，得到细菌的纯培养物，但未得到致病菌的血清型。

通过纸片法药敏试验，表明该菌对头孢均素类抗生素和丁胺卡那高度敏感。而对常规的抗革兰氏阴性菌的抗生素如庆大霉素、四环素等则表现为高度或底度的敏感，说明该病原菌产生了一定的耐药性，不能用传统的抗革兰氏阴性菌的抗生素来治疗。所以，一旦该病发生，必须要做药敏试验。由于增菌培养过程中很容易受到形态相似的巴氏杆菌的污染，所以，为避免不必要的浪费，在每一步的增菌过程中必须对每一份的培养物同时进行简单的纯粹检验，染色镜检为纯的革兰氏阴性杆菌，然后再进行下一步的增菌培养，最后制备了灭活菌苗。经试验证实，两种菌苗按2倍预防剂量，通过不同注射部位对小鼠进行安全试验，接种后未见不良反应，证明两种菌苗安全性好。用菌苗常规量0.1 mL/只分别免疫小鼠，14 d后连同对照组小鼠每只腹腔注射强度菌液，观察14 d后，两种菌苗的免疫保护率都在75%以上，说明两种菌苗的免疫保护效果都很好。菌苗必须在自然平衡至室温时使用。有文献报道，为了提高免疫效果，可在灭活后加等量的氢氧化铝或蜂胶佐剂，制成蜂胶灭活苗更好^[7]。